小型生物活性化合物的多样性不仅被自然所利用，也被人类作为农药和药物来控制杂草、害虫和疾病。现代农药和药物开发的共同原则是，以具有纳米亲和力(或更好)的高度选择性化合物为目标，它们作用于单个分子靶标。最终，生物活性分子的靶点识别仍然是最大的挑战。
有机小分子参与许多生物过程，如代谢途径、信号转导机制和发育过程，在这些过程中往往发挥重要的决定性作用。在植物中，有机小分子在已确定的激素的研究活动中占主导地位，这些激素包括生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸(ABA)、油菜素内酯、茉莉酸酯和水杨酸(SA)，它们共同且各自以其自身影响生长、发育的许多方面，以及与环境的互动。经过漫长而艰巨的研究探索直到最近几年才成功地识别出上述大多数经典植物激素的直接靶点，即受体。虽然在了解植物激素作用的分子机制方面取得了巨大的飞跃，但与动物激素相比，我们的知识仍然是零碎的，许多细节需要阐明;例如，单一激素如何实现不同生理反应的选择性激活？激素修饰的功能意义是什么？激素通路之间的相互作用是如何介导的？或者激素作用最终是如何关闭的？
基于此种种挑战，识别与小信号分子相互作用的蛋白质对理解信号感知和转导的分子机制具有重要意义。
德国科隆马克斯·普朗克植物育种研究所ErichKombrink课题组在期刊Frontiersinplantscience发表了题为Theyeastthree-hybridsystemasanexperimentalplatformtoidentifyproteinsinteractingwithsmallsignalingmoleculesinplantcells:potentialandlimitations的学术论文，本文介绍了Y3H平台的构建和应用的策略和实验细节，包括不同杂交配体的化学合成、合适的cDNA文库的构建、酵母菌株的选择和合适的筛选条件。基于获得的结果和目前的文献，作者讨论了Y3H方法在识别生物活性小分子靶点方面的前景和局限性。
研究结果
1.识别小分子靶标的实验策略
图1酵母三杂交系统用于靶标识别的原理图
小分子靶点的识别是观察到的表型反应的基础，不仅在阐明分子机制的基础科学中是重要的，而且也有很大的实际意义，例如基于指令的药物设计。
靶标识别运用的一项技术是小分子靶点的鉴定与cDNA的克隆，这种表达克隆技术，包括酵母三杂交(Y3H)系统、噬菌体展示和mRNA展示，通过将靶蛋白表达为重组融合蛋白，人工增加了靶蛋白的丰度，特别是当涉及翻译后修饰时，重组融合蛋白可能具有与天然原蛋白不同的特性。Y3H系统不仅提供了对编码靶蛋白的基因的直接访问，而且还依赖于活细胞中的小分子-蛋白质相互作用，而不是在体外，它允许筛选整个蛋白质组的目标。重要的是，这种方法并不局限于模型生物。
研究蛋白质-小分子相互作用的Y3H技术最初由Licitra和Liu()开发，是由酵母双杂交系统延伸而来的，通过引入第三个杂交组分，小分子连接到另一个配体(图1)。也常被用于鉴定三聚体蛋白复合物的组装或直接克隆和识别桥梁蛋白，从而筛选蛋白质和新信号功能的多肽。
2.钓鱼之旅工具箱:搭建Y3H平台
作者将Y3H系统形象的比喻为钓鱼技术，对现有的渔具进行了改造以适应其需要。Y3H作为酵母双杂交系统的一个变体，通常用于识别蛋白质-蛋白质相互作用，由三种混合成分组成:(1)鱼钩；(2)鱼饵；(3)鱼；(图1)。这三个模块的相互作用构建了一个有效的转录激活复合物，激活报告基因的表达。表达报告基因的细胞被选中，并对其质粒DNA进行测序，将揭示小分子靶点的身份。一个功能性的Y3H平台需要策略来构建和优化每个涉及的混合组件。
（1）构建鱼钩HOOK
该钩是一种混合蛋白，由两个功能域组成，DNA结合域(DBD)和配体结合域。作者选择表达编码LexA-DHFR融合蛋白的hook载体的Y3H系统，是因为DHFR与Mtx具有很高的亲和力，并已成功用于Y3H筛选。通过这种选择，作者利用酵母菌株VY，该菌株被设计成包含两个报告基因，LEU2和lacZ，并整合到其基因组中，这两种报告子都被置于LexA操作子的控制之下，而钩子也被整合到酵母基因组中，由LexADBD和DHFR在可诱导GAL1启动子的控制下融合而成。这种综合系统被证明比基于质粒的系统更可靠，导致假阴性的数量显著降低。
（2）构建鱼饵:配体的合成
图2本研究中使用的杂交配体和化合物的化学结构渔夫们都知道，选择合适的鱼饵将决定一次钓鱼之旅的成功。在这里，诱饵是一种混合配体，其中“锚定”部分通过linker与感兴趣的化合物共价连接(图1)。研究的小分子探针通过聚乙二醇(PEG)连接到Mtx部分。作者将小分子与Mtx-PEG部分结合，使用小分子的游离羧酸残基或羟基部分来生成所需的Mtx中间体。该化合物随后与PEG二胺残基偶联，使用标准肽偶联条件，得到关键的Mtx-PEG中间体。